动物实验整体课题-验证基因功能常见思路解析

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动物实验整体课题-验证基因功能常见思路解析

从动物水平研究基因功能的方法

基因功能验证有几种方法

如何验证某一个基因的作用及其作用机制

一、动物实验整体课题-验证基因功能常见思路解析

师兄做了转录组测序实验，老师说让我从这个数据里挖掘一下信息作为我下一步课题的开始，我该怎么做呢？估计很多科研者都会碰到此类的问题。转录组测序一般是通过高通量的方式把对照组和实验组的所有基因的RNA表达水平差异检测出来，虽然数据只有参考价值，但是可以进行大批量的筛选差异基因，进行进一步的验证，这也是大家都会用到的方法。通过转录组测序选择差异基因，需要继续在动物模型和细胞实验中验证基因功能，其中细胞实验基因功能验证小编前面已经写过，在此就不表述了，下面讲讲动物模型中的检验；

1. 首先通过查阅文献以及其他人已发布的芯片数据，进行目标疾病或者目标表现的差异基因资料查询，此外也可以自己收集对照组和处理组的样本进行转录组测序，分析数据，最终都是确定预期靶标基因；

2. QPCR、WB或者免疫组化实验进行表达量验证：一般先进行QPCR表达量验证，若是临床疾病的差异基因A，可以使用临床样本的免疫组化/免疫荧光进行差异基因表达量验证；

免疫荧光实验验证表达量：

3. 确定表达确实有差异后，进行动物模型造模，动物模型种类比较多，下面简单列一些，针对这些模型进行下列实验：

裸鼠成瘤模型

大鼠皮下植入模型

大鼠颈动脉狭窄模型

大鼠皮肤缺损模型

大鼠胆结石模型

兔骨缺损模型

小鼠肺损伤模型

大鼠MCAO模型

豚鼠过敏性鼻炎模型

小鼠胚胎种植

大鼠脊髓损伤模型

大鼠心肌损伤模型

大鼠细菌肺炎模型

大鼠脂肪肝模型

大鼠一型糖尿病模型

大鼠肝纤维化模型

大鼠一型糖尿病模型

大鼠结肠炎模型

大鼠心肌缺血再灌注模型

大鼠酒精性肝炎模型

大鼠腹部感染模型

大鼠睡眠剥夺模型

大鼠血糖波动模型

小鼠肠炎模型

小鼠动脉粥样硬化模型

呼吸系统疾病动物模型

大鼠脑死亡模型

大鼠坐骨神经压迫致痛模型

小鼠银屑病模型

6-OHDA损毁建立部分损伤PD模型

（1）动物造模预实验（通过文献查阅，设计模型预实验，判断动物造模成功率以及时间安排情况，此处以大鼠颈动脉狭窄模型作为案例）

①对照组，6只

②模型组，6只

颈动脉狭窄（CAS）模型建立：Wistar 大鼠，麻醉后暴露小鼠单侧颈总动脉，夹闭颈总动脉，在颈动脉近心端切开小口，使用导丝探入颈总动脉旋转摩擦破坏动脉内膜。生理盐水冲洗动脉腔，缝合切口，恢复血运。

取材：

a造模后在15d和24d对2组动物分别处死3只，取狭窄侧颈动脉标本进行HE染色，判断造模效果。

B 造模后15d和24d取血清以及狭窄侧颈动脉标本进行-80冻存，进行QPCR和WB检测，初步判断A基因在此模型中表达量是否有差异，此外A基因调控的下游信号通路：例如周期或者凋亡相关信号通路是否也有差异。

HE结果显示颈动脉造模效果

WB检测结果（A基因和内参actin）

（2）动物正式实验（此处以大鼠颈动脉狭窄模型作为案例，抑制剂为目标基因A的抑制剂，进行动物注射，也可以用腺相关病毒注射进行A基因的过表达或者敲低）

①对照组，6只

②模型组，6只

③模型组+抑制剂，6只

造模15d后，全部处死取材：血清、颈动脉狭窄端、粪便，进行生化检测、ELISA检测、HE、免疫荧光检测、QPCR、WB、16s细菌多样性检测等方法进行后续机制研究；

Α-SMA免疫荧光染色结果

对照组

模型组

模型组+抑制剂组

ELISA检测结果

常规的动物造模实验都会包含预实验，正式实验。而正式实验就需要通过常规的病理染色、蛋白平台、分子平台等实验手段，可能还会增加微生物实验、CT扫描、TTC染色、行为学检测等，这些都因为模型不同研究的通路不同而有所差异，但是思路都是相通的，需要了解这个模型足够多的背景文献和已经发表的机制进展，进而选择可能的新机制。

一、从动物水平研究基因功能的方法

这个动物水平是什么意思？是从动物个体水平而不是细胞和分子水平的意思？还是对动物为对像，不以植物为对像？
如果是指动物个体水平研究基因功能，多半是以性状比较为主，还有突变体的性状分析。
如果某基因的表达产物或性状是有明确指标的，就以这一指标来分析。从动物个体水平来研究基因功能，还能研究基因之间的相互作用等等。
动物个体水平的基因分析离不开统计学，需要分析性状数据的统计学意义。
如果是指动物而不是植物和微生物，那么动物细胞的特点是无壁，大部分贴壁生长，大部分有接触抑制等特点。所以在基因研究时，会有不同于植物和微生物的转基因方法。
不太理解楼主的问题，以上回答供参考。

二、基因功能验证有几种方法

基因上调（基因转染法）、基因下调（基因干扰法）后看蛋白表达水平、细胞功能改变、在体动物模型中相关功能的变化

三、如何验证某一个基因的作用及其作用机制

　　用基因敲除，看能否表达来验证。

　　先用基因敲除看看,这种代谢产物是否还能表达.

　　还有就是把预测的这个片段导入不能产生这种功能的宿主中去,看看这个被导入的宿主是否也能表达产生这种代谢产物.

　　基因的作用

　　基因有控制遗传性状和活性调节的功能。

　　基因通过复制把遗传信息传递给下一代，并通过控制酶的合成来控制代谢过程，从而控制生物的个体性状表现。

　　基因还可以通过控制结构蛋白的成分，直接控制生物性状。

　　生物体细胞中的DNA分子上有很多基因，但并不是每一基因的特征都表现出来。即使是由同一受精卵发育分化而来的同一人体不同组织中的细胞，如肌肉细胞、肝脏细胞、骨细胞、神经细胞、红细胞、和胃黏膜细胞等。它们的细胞形状都是各不相同的。

　　为什么会出现这种现象呢？原来，细胞核中的基因在细胞的一生中并非始终处于活性状态，它们有的处于转录状态，即活性状态，这时基因打开，有的处于非转录状态，即基因关闭。在生物体的不同发育期，基因的活性是不同的，而且基因的活性有严格的程序。基因活性的严格程序是生命周期稳定的基础。各种不同的生物因其细胞内的基因具有独特的活性调节而呈现不同的形态特征。